Українська версія
English version
Державна установа
"Інститут генетичної та регенеративної медицини
Національної академії медичних наук України"
       
Про інститут Наукові відділи Конференції
 
 
Персональний кабінет:
Логін*:
Пароль*:
  Реєстрація | Ввійти
Головна» Проекти» Тема 0107u008765»
МЕНЮ
 
  Про інститут
  Наукові відділи
  Конференції
  Оголошення
  Проекти
  Співпраця
  Державні закупівлі
  Web-ресурси
  Контакти


Тема 0107u008765
 

Тема № 0107u008765
"Розробка та застосування генних технологій для створення генетично модифікованих клітин та організмів"


Наукові керівники - академік АМН України Г.М. Бутенко, академік АМН України В.А. Кордюм

Строк виконання: 2007-2009 рр.

Мета роботи: 
Відпрацювати методи створення та використання генетично модифікованих організмів для вивчення процесів розселення та диференціювання стовбурових клітин; отримати рекомбінантні білки, які беруть участь в даних процесах, або застосовуються при їх вивченні.

Об’єкт дослідження:
Миші ліній С57ВL/6, ICR, СВА/Са, FVB, FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J; рекомбінантні білки, в тому числі, одноланцюгові антитіла; мезенхимальні стовбурові клітини.

Методи дослідження:
виділення та культивування доімплантаційних ембріонів мишей, мікроін"єкція генетичного матеріалу в пронуклеус, аспірація та трансплантація бластомерів між бластоцистами; мультипараметричне високошвидкісне фенотипування та сортування клітин методом проточної цитометрії; виділення, культивування і трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку та фетальної печінки, фетальних нейральних стовбурових клітин, культивування мультипотентних стромальних стовбурових клітин пуповини людини; моделювання ішемічного пошкодження головного мозку та опіків шкіри у мишей; імуногістохімічні методи; фаговий дисплей при отриманні одноланцюгових рекомбінантних антитіл.

Основні результати:
В рамках виконання НДР проведено експерименти з відпрацювання технологій виділення, мікроманіпуляцій, культивування та трансплантації ембріонів мишей на ранніх стадіях ембріогенезу, як етапи для їх генетичної модифікації.
Клоновано ген LIF людини, зконструйовано штам-продуцент цього білку, а також створена генетична конструкція для забезпечення синтезу LIF людини у клітинах ссавців у формі, що дозволяє його секрецію назовні.
Відпрацьована технологія отримання МСК з пуповини людини, виділені клітини охарактеризовані за морфологією та поверхневими маркерами, специфічними для МСК. Показано, що при веденні клітин поза організмом змінюється практично всі характеристики, та вже на рівні 3-го пасажу починається спонтанна диференціація МСК пуповини в бік адіпо – та хондрогенезу
Проведено фенотипування субпопуляцій гемопоетичних та мультипотентних стромальних стовбурових клітин кісткового мозку, пуповини та фетальної печінки методом проточної цитометрії з одночасним використанням 5 маркерів. Відпрацьовано процедури сортування гемопоетичних стовбурових клітин для наступного їх культивування та трансплантації тваринам з моделюванням патологічних станів.
Показано розселення мічених зеленим флуоресцентним білком (GFP) трансплантованих гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку та фетальної печінки в інтактному організмі в ранні строки після трансплантації. Оцінено проліферативний потенціал власних та донорських клітин в кістковому мозку мишей-реципієнтів.
Проведено трансплантацію фетальних нейральних стовбурових клітин, мічених GFP, тваринам з моделлю церебральної ішемії та показано розселення і диференціювання донорських клітин в головному мозку реципієнтів в динаміці.
Запропоновано способи моделювання опіків шкіри у лабораторних мишей з метою подальшого локального або системного введення мультипотентних стромальних клітин, мічених GFP для вивчення перспектив застосування стовбурових клітин в регенеративній медицині.
Проведено дизайн генетичних касет та сконструйовано рекомбінантні плазміди для продукції химерних білків на основі ScFv та деяких білків-партнерів (лужної фосфатази, флюоресцентного білка mCherry), а також білка А Staphylococcus aureus та ЦЗД (целюлозо-зв’язувального домену). Оптимізовано умови їх продукування, виділення та очищення, а також визначено імунологічні, молекулярні та біохімічні характеристики. Показано можливість використання одержаних химерних білків для імунодетекції (імуноцитохімії, FACS-аналізу, ELISA та вестернблотингу).

Результати роботи оформлені у вигляді звіту, 5 статей, 17 тез, 3 патентів, 1 заявки на корисну модель.